Los estudios previos han demostrado que la glicoproteína de superficie celular CD163, identificada en macrófagos, y PRRSV interactúan en endosomas tempranos durante el proceso de infección (Van Gorp et al., 2009), y el nivel de expresión de CD163 en los macrófagos alveolares se correlaciona bien con el nivel de replicación del PRRSV (Patton et al., 2009). Por tanto, CD163 podría ser un gen candidato para ser inactivado mediante edición genómica, bloqueando así el proceso de infección del PRRSV.

Recientemente, un sistema CRISPR/Cas9 diseñado para inactivar el gen CD163 ha mostrado una alta eficiencia tras su microinyección en zigotos de cerdo producidos in vitro (Whitworth et al., 2014).

El síndrome reproductivo y respiratorio porcino, producido por la infección de un virus (PRSSV), es endémico en la mayoría de los países productores de porcino causando enormes pérdidas en la industria (Neumann et al., 2005). Se caracteriza por fallos importantes en la reproducción, así como por la presencia de una enfermedad respiratoria en animales de todas las edades.

La posibilidad de generar cerdos resistentes a enfermedades específicas, en este caso al PRRSV, es un reto actual no sólo para la industria porcina, sino para la propia Ciencia que ha puesto a nuestra disposición una herramienta, la tecnología CRISPR/Cas9, que puede revolucionar, a corto plazo, los conceptos actuales de producción animal, ingeniería genómica y biomedicina.

El propósito general de la actividad que se plantea realizar en el presente proyecto es el de desarrollar un sistema de modificación genética de cerdos mediante la microinyección intracitoplásmica de Cas9 mRNA y gRNA en zigotos. En el marco de este objetivo general, se plantea la disrupción del gen CD163 con la finalidad de generar animales resistentes al PRRSV.

Estos animales resistentes a la enfermedad serían de máxima utilidad para investigar el progreso de la misma, para entender más eficientemente el modo de infección y para reducir el impacto económico que la enfermedad tiene sobre la industria porcina. Alternativamente, los animales genéticamente modificados resistentes a la enfermedad podrían ser introducidos en el stock de reproductores de la explotación.

Fases del proyecto

1. Fase 1 - Cultivo de los zigotos microinyectados hasta el estadio de blastocisto: efecto de diferentes volúmenes del RNA mensajero que codifica Cas9 y de los gRNA durante las microinyecciones sobre la eficiencia en la producción de blastocistos y mutaciones del gen CD163 en los mismos.
2. Fase 2 - Transferencia a hembras receptoras de los zigotos microinyectados con CRISPR/Cas9: Porcentajes de gestación y genotipado de fetos de 28 días. Esta actividad tiene como finalidad evaluar la eficiencia del sistema en términos de gestaciones tras la transferencia embrionaria y de incidencia y frecuencia de la disrupción del gen CD163 en fetos en el primer cuarto de la gestación.
3. Fase 3 - Transferencia de zigotos microinyectados con CRISPR/Cas9: Genotipado de los lechones nacidos y resistencia al PRRSV. En esta actividad se pondrá en evidencia las posibilidades del sistema, tanto a nivel de eficiencia en términos de fertilidad y prolificidad como de la verdadera resistencia al PRRSV de los lechones nacidos