El objetivo principal es avanzar en el conocimiento del mecanismo catalítico de la enzima Acetyl-CoA sintetasa (Acs) y su regulación por acetilación de lisinas en Escherichia coli. Además, se llevará a cabo la caracterización biofísica de esta enzima.

Actividades en el Departamento de Farmacia y Biotecnología

En el Departamento de Farmacia y Biotecnología de la Universidad de Bolonia, se quieren realizar las siguientes actividades:

1. Caracterización biofísica de la enzima Acs.
2. Estudio calorimétrico de la enzima y varios mutantes.

Modelo tridimensional de la enzima Acs

Se construirá un modelo tridimensional de la enzima Acs, mediante herramientas bioinformáticas, a partir de otras proteínas cristalizadas en presencia de ATP.

Selección de residuos fundamentales y construcción de mutantes

Empleando este modelo se seleccionarán residuos fundamentales para la unión a ATP, su sustrato principal. Una vez seleccionados los residuos, se llevará a cabo la construcción de los mutantes mediante técnicas de biología molecular.

Técnica ITC y estudios calorimétricos

Se empleará la técnica ITC para estudiar calorimétricamente la unión de las proteínas Acs a su sustrato principal ATP y a diferentes análogos y potenciales inhibidores, como AMP y cAMP. De esta manera podremos comparar los calores y cinéticas de unión de los mutantes con los obtenidos para la enzima Acs nativa, tanto en estado desacetilado como acetilado.

Caracterización cinética de las proteínas mutantes y nativas

De la misma manera, se evaluará el papel de cada una de estas mutaciones en el mecanismo catalítico de Acs mediante la caracterización cinética de las proteínas mutantes y las nativas.

Cristalización de la proteína Acs de E. coli unida a ATP

Por último, se intentará llevar a cabo, por primera vez, la cristalización de la proteína Acs de Escherichia coli unida a ATP.

Los resultados que se esperan conseguir supondrán un importante avance en el estudio de esta enzima y en el metabolismo del acetato de E. coli.