El plasma seminal (PS) de porcino contiene un gran número de vesículas extracelulares (VEs) que son heterogéneas en tamaño y forma. Esta heterogeneidad indicaría la existencia de subpoblaciones de VEs en el PS. Dichas subpoblaciones tendrían diferente origen celular y también diferente celular diana. Los procedimientos actuales de aislamiento y separación de las VEs son poco eficientes, principalmente en cuanto a pureza. Mejorar dicha eficiencia y aislar por separado las subpoblaciones de VEs presentes en los fluidos corporales es un reto de la comunidad científica. En este contexto, el objetivo general de esta propuesta será aislar en pureza, separar y caracterizar, tanto fenotípica como composicional y funcionalmente, subpoblaciones de VEs presentes en el PS de porcino.

Para alcanzar este objetivo general, la propuesta propone cinco objetivos específicos, que cada uno de ellos se desarrollará en uno de los cinco experimentos propuestos. Los eyaculados procederán de verracos utilizados en programas comerciales de inseminación artificial.

1. Desarrollo de procedimientos de aislamiento de VEs basados en la cromatografía de exclusión por tamaño
2. Aislamiento eficiente, en cantidad y máxima pureza, del máximo número de subpoblaciones de VEs del plasma seminal de porcino
3. Análisis del proteoma de membrana de cada una de las subpoblaciones de VEs seminales aisladas para identificar proteínas de membrana que caractericen cada subpoblación
4. Desarrollo de procedimientos de inmunoafinidad que permitan separar de forma rápida y eficiente (en cantidad y pureza) subpoblaciones de VEs del plasma seminal de porcino
5. Caracterización fenotípica, composicional y funcionalmente las subpoblaciones de VEs del plasma seminal de porcino separadas por procedimientos de inmunoafinidad

Las VEs se caracterizarán mediante:

• Crio-microscopia (número, tamaño y forma y contaminación)
• DLS (distribución por tamaño)
• Citometría de flujo de alta resolución (número, proteínas de membrana y proteínas libres contaminantes)
• Análisis ómicos (contenido en proteínas, metabolitos y pequeños RNAs)

Aislar en total pureza y caracterizar composicionalmente las subpoblaciones de VEs seminales permitirá:

1. Determinar su relevancia en la fertilidad del verraco
2. Identificar biomarcadores de fertilidad, y
3. Analizar su relevancia clínica en problemas de sub- o in-fertilidad.