El factor de crecimiento transformante beta (TGFb) pertenece a una gran familia de citoquinas y está implicado en procesos de proliferación celular, morfogénesis, producción de matriz extracelular y apoptosis. Los principales mediadores de su ruta de señalización son las proteínas Smad.

Búsqueda de nuevas proteínas que interaccionan con Smad2

En una búsqueda de nuevas proteínas que interaccionaran con Smad2, utilizando el sistema Doble Híbrido CytoTrap y una librería de expresión obtenida de epitelio pulmonar adulto, se identificaron un centenar de cDNA distintos.

Proteína Sirt1

Entre estos clones se encontró la proteína Sirt1, una desacetilasa de histonas de tipo III dependiente del cofactor NAD+. Sirt1 desacetila histonas y varios factores de transcripción, entre ellos p53 y FOXOs. Sirt1 participa en la desacetilación de Smad7, un elemento regulador negativo de la ruta de TGFb.

Interacción Sirt1 y Smad2

Hemos estudiado la interacción Sirt1 y Smad2 en células HEK293T. La interacción no depende de la fosforilación de Smad2 dependiente de TGFb, sin embargo, si es necesaria la actividad catalítica de la proteína Sirt1. Por otro lado, Sirt1 es capaz de unirse a Smad3 pero no a Smad4.

Efecto de Sirt1 sobre la activación de un gen reportero dependiente de TGFb

Sirt1 tiene un efecto negativo sobre la activación de un gen reportero dependiente de TGFb, DE-luc, y su eliminación mediante siRNA tiene el efecto contrario.

Ensayos de DNA pulldown assay con promotores específicos

Por otro lado, mediante ensayos de DNA pulldown assay con promotores específicos que responden a la activación con TGFb como es el promotor CAGA12, hemos podido comprobar que Sirt1 se une a dicho promotor junto con Smad3 y Smad4 y esta interacción es dependiente de la estimulación de las células con TGFb.

Objetivo del estancia en el Centre for Molecular Life Science

El objetivo de la estancia en el Centre for Molecular Life Science de la Universidad Radboud en Nijmegen (Holanda) es la de realizar un screening masivo de los promotores a los que Sirt1 se une junto con Smad2 y Smad3 antes y durante la estimulación de células HaCaT con TGFb. Se pretende estudiar si la presencia de Sirt1 tiene algún efecto sobre determinados promotores dependientes de Smad2/3.

ChIP-seq

Para ello, se realizará una novedosa técnica llamada ChIP-seq. Éste es un procedimiento usado para analizar interacciones proteína-DNA, el cual combina la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) con una secuenciación masiva paralela de DNA para identificar las secuencias que están unidas a la proteína previamente inmunoprecipitada.

Requisitos y conocimientos

Para realizar este estudio se requiere de una equipación y de unos conocimentos que el departamento del Dr Stunnenberg posee.

Contribución al desarrollo de la tesis doctoral

Los datos que salgan de este estudio podrán ser decisivos para poder desvelar el papel que juega Sirt1 en la vía de señalización de TGfb y contribuiran de manera decisiva al desarrollo y finalización de mi tesis doctoral.