18/07/2003
José Meseguer Peñalver y Victoriano Mulero Méndez
Sistema Inmunitario Inespecífico de Peces Teleósteros
Biología Celular
Facultad de Biología
Universidad de Murcia
Murcia
España
Durante el desarrollo de la presente Tesis Doctoral se ha llevado a cabo la caracterización de la interleuquina-1β (IL-1β) de dorada (Sparus aurata L.)
En primer lugar se abordó la clonación del gen de la IL-1β de la dorada mediante una aproximación de clonación homóloga. El cDNA de la IL-β de dorada contiene 1.271 nucleótidos (nt) que incluyen un marco de lectura abierta de 762nt, un extremo 5' no traducido (UTR) de 102 nt y un extremo 3' UTR DE 407 nt. El gen está compuesto por 5 exones y 4 intrones. La secuencia posee un alto grado de homología a nivel de aminoácidos con las secuencias de IL-1β de sargo (Diplodus puntazzo) y de dentón (Dentex dentex), especies de la misma familia de la dorada y cuyas IL-1βs también han sido parcialmente obtenidas en el presente trabajo. El transcrito de la IL-1β se acumula en diferentes órganos limfomieloides en peces infectados experimentalmente, así como en leucocitos y macrófagos estimulados in vitro con derivados bacterianos (LPS y DNA) y linfoquinas.
En una segunda etapa del estudio, la IL-1β de dorada se expresó en Escherichia coli como una proteínade fusión a 6xHis y se purificó mediante cromatografía de afinidad a una resina de cobalto. La IL-1β purificada se utilizó como inmunógeno para obtener un anticuerpo policlonal específico.
Por último se estudió la producción y el mecanismo de liberación de la IL-1β de dorada utilizando el anticuerpo obtenido. Tanto el LPS y el DNA bacteriano como las linfoquinas fueron capaces de inducir la acumulación intracelular de un polipéptido de unos 30kDa que representaa el precursor de la IL-1β(proIL-1β). La adición de ATP no produjo el procesamiento ni la liberación de la IL-1β en las célular de riñón cefálico. Sin embargo, la adición de ATP a los fibroblastos de la línea celular de dorada SAF-1 produce la liberación de microvesículas conteniendo una forma de la IL-1β de unos 22kDa. La adición de un inhibidor específico de la caspasa 1 previene el procesamiento post-traduccional de la IL-1β, resultando en la liberación de la proIL-1β tras la adición de ATP.
